Bakteriologisk odling eller PCR-analys av mjölkprover?

Det vanligaste sättet att undersöka mjölkprover för att fastställa vilken bakterie som orsakat till exempel en celltalsförhöjning är med bakterieodling, men på senare år kan även mjölkproverna undersökas med hjälp av PCR-analys. Vid bakterieodling av mjölkprover är man beroende av att det finns levande och någorlunda pigga bakterier i provet för att de ska växa på en odlingsplatta. Bakterieodling är en relativt billig metod, men det tar 1-2 dygn innan man har ett svar. Vid PCR-analys påvisas DNA från olika bakterier och bakterierna behöver därför inte vara levande eller livskraftiga för att kunna påvisas. PCR-analys är en snabb och väldigt känslig metod, men kan bara hitta de bakterier den har utvecklats för.

Eftersom PCR-analys av mjölk är en automatiserad och snabb metod skulle man samtidigt som man analyserar celltal och mjölksammansättning i provmjölkningsproverna även kunna undersöka bakterieförekomst i dessa prover. Då skulle man både får reda på vilka kor som har höga celltal, men samtidigt också vilken bakterie som kanske orsakat celltalshöjningen. Innan man kan införa en sådan analys är det dock viktigt att undersöka hur bra metoden fungerar på just provmjölkningprover – kommer alla provsvar visa på bakteriefynd då metoden är så känslig? Kommer även kor med bakterier i endast en juverdel att kunna hittas?

För att svara på dessa frågor har vi i ett forskningsprojekt undersök hur väl resultaten från PCR-analys av provmjölkningsprover överensstämmer med konventionell bakterieodling av juverdelsmjölkprover tagna vid samma tillfälle. Endast kliniskt friska kor provtogs i denna studie.

I de allra flesta mjölkproverna (85-92 % av proverna, se figur 1) kunde vi inte påvisa de vanligaste förekommande mastitbakterierna (Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae eller Streptococcus uberis) varken med PCR-analys eller med bakterieodling (se figur 1, de gröna staplarna). Detta var förväntat eftersom korna mjölkproverna togs ifrån var kliniskt friska och de borde inte ha bakterier i mjölken. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) var dock desto vanligare att påvisa, men då framförallt med PCR-analys (se figur 1, de gula och röda staplarna).

bcpcrgraftillwebben

Figur 1. Överensstämmelse mellan bakteriefynd i mjölkprover analyserade med bakterieodling eller PCR-analys för fyra vanliga mastitorsakande bakterier. BO-=Bakterien inte påvisad med bakterieodling, BO+=Bakterien påvisad med bakterieodling, PCR-=Bakterien inte påvisad med PCR-analys, PCR+=bakterien påvisad med PCR-analys, KNS=Koagulasnegativa stafylokocker.

När resultatet inte överensstämde mellan bakterieodling och PCR-analys (se figur 1, de gula eller blåa staplarna) var det vanligare att PCR-analysen påvisade bakterier där bakterieodlingen inte påvisade någon bakterie än att bakterieodlingen påvisade bakterier där PCR-analysen inte påvisade någon bakterie. Så generellt sett hade PCR-analysen en bättre förmåga att kunna påvisa bakterier i mjölkprov jämfört med bakterieodling.

Frågan är dock om de bakterier som påvisades alltid hade betydelse för juverhälsan hos de kor som provtogs. Tittar vi på hur celltalet ser ut hos de kor där bakterier påvisat (figur 2) kan vi se att mediancelltalet ligger högre hos de kor där bakterieodlingen påvisade bakterier än hos de kor där PCR-analysen påvisade bakterier. Detta kan tyda på att en del av de bakterier som påvisades i PCR-analysen eventuellt inte kom från juvret utan var en kontamination från till exempel spenhuden eller omgivningen och som då inte heller hade en påverkan på celltalet.

bcpcrcellgraftillwebben

Figur 2. Celltal i mjölk hos kor med fynd av olika mastitorsakande bakterier påvisade med bakterieodling (BO+) eller PCR-analys (PCR+).

Slutsatsen från projektet är att PCR-analys av provmjölkprover oftast är bättre på att påvisa bakterier än bakterieodling av juverfjärdedelsprover tagna vid samma tillfälle, men att inte alla bakterier som påvisas av PCR-analysen verkar ha en direkt påverkan på celltalet. Om PCR-analys ska användas för analys av provmjölkningsprover bör man tillämpa en aseptisk provtagning för att minska risken för att få med kontaminationsbakterier.

Mer information om PCR-analys finns på SVAs hemsida:  http://www.sva.se/analyser-och-produkter/analyser-av-djur-och-foder/notkreatur1/mastit

Mastitbakterier i siffror

Jag har sammanställt vilka som är de vanligaste (och de mer ovanliga)fynden i de mjölkprover som kommer in till SVA. Siffrorna bygger på drygt 16 000 mjölkprover som kommit in till SVA under september 2015 till och med augusti 2016. Proverna kommer både från kliniska mastiter, subkliniska mastiter och diverse andra provtagningsorsaker.

Baserat på drygt 16 000 prover inkomna till SVA.
Baserat på drygt 16 000 prover inkomna till SVA.

De två vanligaste diagnoserna är ingen växt alls (vilket i mina ögon bara är ett bevis på att provet är taget på rätt sätt) och tyvärr också blandflora. Blandflora innebär att vi inte kunnat hitta någon specifik infektion men att bakterien som orsakar problemen mycket väl kan finnas i provet men döljs av andra bakterier. Här kan ni se hur prover ska tas för att undvika blandflora och här kan ni läsa om fler tips för att ta det perfekta mjölkprovet.

Den här tabellen visar de lite mer ovanliga juverpatogenerna som vi hittat färre än 100 gånger samma tidsperiod:

diagnoser-2015-2016-ovanligare-2

 

 

Hur mjölkar man en kamel?

Nyligen var vi i Kenya för att planera vårt kamelmastitprojekt som Ylva bloggade om tidigare. Mastit på mjölkkameler är tyvärr väldigt vanligt, i en del studier uppges förekomsten till över 80 procent. Precis som för andra mjölkproducerande djur har det en negativ inverkan på både produktion och djurhälsa. Mastiter (juverinflammationer) utan kliniska symtom (så kallade subkliniska) som inte upptäcks kan sprida sig till stora delar av besättningen. Dessutom har man ingen tradition av att pastörisera kamelmjölken i Kenya, tvärtom menar man att det försämrar kvaliteten, och då är risken för att människor får i sig smittämnen via mjölken ännu högre.

Glada kameler
Glada kameler
Böld som bildats på ett kameljuver.
Böld som bildats på ett kameljuver

Vid vårt besök åkte vi till ett forskningscenter i regionen Laikipia där de har en egen kamelhjord. Vi fick hälsa på kamelerna och titta på när de mjölkades och det var lite annorlunda jämfört med rutinerna på till exempel en svensk mjölkgård med kor.

Hungriga kamelkalvar får dia från mammorna efter att de mjölkats
Hungriga kamelkalvar får dia från mammorna efter att de mjölkats

Till att börja med hålls kalvarna skilda från sina mödrar under natten i en stor inhägnad som kallas boma. Då en kamel skall mjölkas släpps kalven ut och får förstimulera juvret för att inducera mjölknedsläpp. Hos kor finns ett hålrum i juvret som mynnar i spenen som kallas för juvercistern där en del av den bildade mjölken lagras mellan mjölkningarna. Kameler har nästan ingen juvercistern  alls så när mjölknedsläppet kommer igång syns det tydligt på att spenarna blir mjölkfyllda och kan växa upp till två tredjedelar på längden.  När mjölken släppts ner knuffas kalven undan och två män mjölkar från varsin sida ner i en bunke som en av männen balanserar på knät, han står alltså på ett ben och mjölkar!

Kamelerna mjölkas från två håll samtidigt
Kamelerna mjölkas från två håll samtidigt

Själva mjölkningen går relativt fort eftersom kamelerna oftast inte producerar mer än 1-10 liter per dag . Efteråt får kalven dia lite av det som finns kvar vilket oftast inte är så mycket. Konkurrensen mellan kalv och människa om mjölken är tyvärr till kalvens nackdel och kalvdödligheten ligger på cirka  50 procent hos pastoralisterna  (pastoralister är nomadiserande folkgrupper som försörjer sig på djurhållning).

Kamelkalvarna var hungriga och stod och ropade efter mamma och mat
Kamelkalvarna var hungriga och stod och ropade efter både mamma och mat
Kamelkalvarna kan fortsätta dia upp till 2 års ålder
Kamelkalvarna kan fortsätta dia upp till 2 års ålder, då är de nästan lika stora som sina mammor

Projektet kommer att fokusera på juverhälsa och undersöka förekomsten av subklinisk mastit hos mjölkande kameler i pastoralisthjordar. Vi kommer också titta på antibiotikaresistens och intervjua djurhållarna för att undersöka riskfaktorer för mastit. Målsättningen är att utveckla en kontrollstrategi för att förbättra juverhälsan och på så vis förbättra produktionen, livsmedelsäkerheten och djurvälfärden.

Större delen av projektgruppen på Mpala Research Centre
Större delen av projektgruppen på Mpala Research Centre
Mt Kenya strax efter soluppgången
Mt Kenya strax efter soluppgången
Kamelerna i sin boma där de hålls under natten. Om dagarna släpps de ut för att beta.
Kamelerna i sin boma där de hålls under natten. Om dagarna släpps de ut för att beta.

 

Bra antibiotikaläge i Sverige presenterades i Indien

amr-indien

Undertecknad var i början av november inbjuden att tala på ett möte i Indien med titeln ”International Workshop on National Action Plan on Antimicrobial Resistance for Developing Countries”. Det var en glädje att få möjlighet att presentera Sveriges mycket fina arbete för en klok antibiotikaanvändning. Särskilt roligt var det att presentera Sveriges mjölkkor som det synnerligen goda exemplet. Mastit (juverinflammation) är den sjukdom som kräver mest antibiotika inom mjölksektorn. I Sverige behandlar vi bara omkring en tiondel av korna med antibiotika mot så kallad klinisk (synlig) mastit under varje mjölkperiod. Dessutom utgörs nästan nittio procent av behandlingarna av smalspektrigt penicillin vilket är väldigt bra ur ett resistensperspektiv. Jag vill dock trycka på att den här siffran skulle kunna vara i det närmaste hundra procent eftersom de flesta övriga behandlingar med mer bredspektriga substanser sannolikt är mer eller mindre onödiga. Vidare använder vi i Sverige, selektiv sintidsterapi där vi bara antibiotikabehandlar de kor som har mastit vid sinläggning. I stora delar av världen tillämpas istället sintidsbehandling av alla kor, även de friska. Dock ökar intresset i flera länder för den nordiska varianten med sintidsbehandling bara av sjuka kor.

Indiska rupiesedlar med höga valörer blev helt plötsligt ogiltiga i ett försök att stävja korruption och svarta pengar
Indiska rupiesedlar med höga valörer blev helt plötsligt ogiltiga i ett försök att stävja korruption och svarta pengar

Sverige fick mycket uppskattning för sitt goda läge och tjänade verkligen som inspiration för de fortsatta diskussionerna. Läget i Indien är förstås ett helt annat. Där används antibiotika fortfarande som tillväxtbefrämjare i fodret. Något som Sverige var först i världen att förbjuda redan 1986. Dessutom kan antibiotika köpas över disk utan recept. Dessutom sker en stor del av tillverkningen av antibiotika i just Indien och reningen på dessa fabriker är ofta bristfällig och vattendrag nedströms antibiotikafabrikerna är ofta kontaminerade med antibiotikarester.

Så det var med blandade känslor jag reste hem. Glad över Sveriges situation och glad över att Indien och liknande länder tar frågan på allvar och vill arbeta för ett förbättrat läge. Men samtidigt kan jag inte sticka under stol med att en viss känsla av hopplöshet kom över mig. Jag hoppas dock att loppet inte är kört utan att vi i även i framtiden ska kunna behandla sjuka djur och människor med antibiotika.

Delhi upplevde de värsta luftföroreningarna på 17 år. Smogen låg tjock över staden.
Delhi upplevde de värsta luftföroreningarna på 17 år. Smogen låg tjock över staden.

Helcococcus vad är det?

På senaste tiden har vi svarat ut en för oss ny bakterie – Helcococcus species eller Helcococcus ovis. Det är en grampositiv bakterie som ofta växer ihop med Trueperella pyogenes ( fd Arcanobacterium pyogenes, fd Actinomyces pyogenes).

Vi ser framförallt bakterien vid kliniska mastiter och den kan förekomma både själv och tillsammans med pyogenes. Bakterien växer långsamt och ser bara ut som en grön hinna de första dagarna men i kombination med med pyogenes växer den bättre.

Varför har vi börjat svara ut den här bakterien?
Tidigare har vi inte kunnat typa Helcococcus men med vår nya typningsteknik maldi-tof kan vi nu artbestämma det som vi tidigare bara trott varit en missfärgning av plattan.

helcococcus2
Helcococcus ser mest ut som en grönfärgning på plattan

Vad har den för betydelse?
Tyvärr vet vi inte vad bakterien har för betydelse vid juverinflammationer förutom att den inte är helt ovanlig vid kliniska mastiter.

Helcococcus ovis bland annat hittats i samband med lungbölder hos nötkreatur och häst, endokardit hos nöt och ett fall av subklinisk mastit hos får. Det finns inga rapporter om bakterien i samband med juverinflammation hos kor.

Förhoppningsvis kommer vi lära oss mer nu när vi har möjlighet att hitta och artbestämma bakterien.

 

Favorit i repris – Seminarium om Streptococcus agalactiae

logovxamed-logga

 

 

Seminariet vänder sig till veterinärer med nötkreaturspraktik och kommer
att ta upp klinik, förekomst, patogenes, riskfaktorer, diagnostik, behandling, sanering samt förebyggande åtgärder vid S. agalactiae-mastit.
Aktuella frågeställningar kommer att diskuteras.

Tid och plats 09.30 – 16.00 den 15 mars 2017
Växa Sverige, Franzéngatan 6, 112 51 Stockholm

Föreläsare Charlotta Fasth, SVA & Ylva Persson, Växa Sverige/SVA
Åsa Lundberg & Håkan Landin, Växa Sverige

Kursavgift 1 000:- exklusive moms, inklusive kaffe och lunch

Anmälan Via e-post senast den 6 februari 2017; hakan.landin@vxa.se
Begränsat antal platser, tidig anmälan ger förtur.
Ange namn, e-post och faktureringsadress.

Frågor Håkan Landin, Växa Sverige; 070-350 24 82;
hakan.landin@vxa.se

Anmärkning Repris på ett seminarium anordnat på SVA 2016-02-10.

Vad ligger celltalet på hos en frisk ko?

När vi pratar om celltal hos mjölkkor menar vi generellt antalet vita blodkroppar per milliliter mjölk. Celltalet påverkas av många olika faktorer, till exempel laktationsstadium, ras och ålder, men den enskilt viktigaste faktorn som påverkar celltalet är om kon har fått en infektion i juvret som lett till ett inflammatoriskt svar. De vita blodkropparna försvarar juvret mot de invaderande mikroorganismerna och celltalet kan öka till flera miljoner celler per milliliter mjölk.

Men vad ligger celltalet på hos en frisk ko?

Resultat från vår egen forskning visar att över hälften av korna utan fynd av bakterier i juvret har ett celltal under 50 000 celler per milliliter mjölk och att de allra flesta har ett celltal under 200 000 celler per milliliter mjölk oavsett ålder, ras och laktationsstadium (se figur).

diagramcelltal2

Vid fynd av koagulasnegativa stafylokocker, som historiskt sett inte orsakat så höga celltal hos kor, är det också en majoritet av korna som ligger under 200 000 celler per milliliter mjölk, men andelen kor med mindre än 50 000 celler per milliliter mjölk är betydligt lägre än för kor utan fynd av bakterier.

Majoriteten av kor med fynd av övriga bakterier, så som till exempel Staphylococcus aureus eller Escherichia coli, har ett celltal över 200 000 celler per milliliter mjölk och cirka hälften av korna har ett celltal på över 400 000 celler per milliliter mjölk.

Även om andra faktorer än infektion i juvret av mikroorganismer kan påverka celltalet är de faktorerna ofta svåra att göra något åt. Att celltalet stiger med kons ålder, eller att SRB-kor har lägre celltal än kor av svensk holstein-ras är svårt att direkt påverka. Däremot går det att förhindra att kor får juverinflammation orsakad av mikroorganismer genom ett förebyggande juverhälsoarbete.

Man tjänar pengar på att ha kor med låga celltal; redan vid ett celltal över 50 000 celler per milliliter mjölk minskar mängden producerad mjölk. I vår studie kunde vi se att en ko med ett celltal på cirka 50 000 celler per milliliter mjölk producerade cirka 4 kg mer mjölk per dygn jämfört med en ko med ett celltal på cirka 200 000 celler per milliliter mjölk.

Friska kor har låga celltal och kor med lågt celltal producerar mer mjölk!

Tre saker att tänka på vid tolkning av PCR-resultat

ror-med-bronopol-beskuren

Vid mastitfrågeställning är PCR-resultat tacksamma – de ger svart på vitt vilken eller vilka bakterier som finns i provet, men är det verkligen så enkelt?

Här är tre viktiga saker att tänka på när du tolkar ditt PCR-svar:

1. Med PCR svaras bara de bakterier ut som finns med i den aktuella undersökningen

Vid negativt resultat är det viktigt att tänka på att mjölkprovet kan innehålla mer ovanliga bakterier som inte ingår i testen.

Vid ett positivt resultat är det också viktigt att tänka efter – även om PCR-resultatet visar på enbart en sorts bakterier kan provet mycket väl innehålla flera olika bakterier men där bara en ingår i undersökningen. Bakterien som står på svaret kanske bara är en föroreningsbakterie som egentligen förekommer i blandflora.

2. Testen är jättekänslig

PCR-undersökning vid juverhälsoproblem är mycket känsligare än odling och hittar både levande och döda bakterier.

Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae

En känslig test – det måste väl alltid vara bra? Ja – när vi letar efter bakterier som är väldigt juverbundna och inte ska finnas alls  i besättningen, till exempel Mycoplasma bovis eller Streptococcus agalactiae så är det oerhört värdefullt med en känslig test. MEN det är viktigt att tänka på att vid provmjölkningsprover finns det en risk för ”carry-over” vilket innebär att bakterier från föregående ko kommer med i provet från nästa ko. Det här kan leda till falskt positiva prover och det är viktigt att tolka svagt positiva prover med en nypa salt.

När vi letar efter omgivningsbakterier, till exempel E coli eller Streptococcus uberis som orsak till höga celltal så säger en väldigt känslig test inte så mycket. Ja bakteriens DNA finns där men är det bara en förorening eller är bakterien orsak till den subkliniska mastiten?

Speciellt när proverna inte tas efter noggrann rengöring och desinfektion, som till exempel i samband med provmjölkning, är det svårt att dra några slutsatser vid fynd av miljöbakterier.

Testen är känslig – men hittar inte en nål i en höstack!


Det är lätt att förlita sig på att PCR-undersökningen är så känslig så att den alltid hittar bakterien om den finns i besättningen. I ett tankmjölksprov som inte visar några spår av  Streptococcus agalactiae eller Mycoplasma bovis från en besättning på 300 kor kan det fortfarande dölja sig någon enstaka smittad ko. För att friförklara en besättning krävs upprepad provtagning. En tumregel är att i en besättning på 50 djur är ett PCR-resultat hyfsat pålitligt. Vid större besättningar är det viktigt att ta flera prover vid olika tillfällen.

3. Resistensundersökning

I vissa PCR-undersökningar ingår test för blaZ-genen. Om en stafylokock har blaZ-genen är den inte känslig för penicillin (det vi brukar kalla PC+). Kom ihåg att det inte går att säga om blaZ-genen, när den påvisas, hör till en koagulasnegativ stafylokock eller till en Staphylococcus aureus utan bara att genen finns i provet.

Nytt kliniskt fall av Mycoplasma bovis – upptäckt vid odling

bovismilk1
Exempel ur en gammal bok på mjölk från kor infekterade med Mycoplasma bovis

 

 

 

 

 

 

Ytterligare ett fall av den smittsamma och i Sverige relativt ovanliga mastitbakterien Mycoplasma bovis upptäcktes i en besättning i Skåne förra veckan. Det här är den tredje besättningen de senaste åren som har haft kliniska mastiter orsakade av M bovis.

Misstanken uppstod ovanligt nog genom odling (sic!)- ett prov från en kliniskt sjuk ko kom in för rutinmässig mastitodling. Tack vare vårt nya typningsinstrument, maldi-tof, började vi misstänka växt av mykoplasma. Vi kunde konfirmera att det verkligen rörde sig Mycoplasma bovis med hjälp av PCR.

Här finns mer att läsa om mastit orsakad av mykoplasma:

 

 

 

Sista inlägget från mastitkonferensen i Nantes

Sista sessionen, sista dagen handlade om olika erfarenheter av att jobba med mastitkontrollprogram. Den inleddes av Hari Kumar från Indien. I Indien som har 15,4 miljoner mjölkproducenter äger 95 procent av lantbrukarna bara en till två kor. Enligt olika studier från Indien ses upp till 80 procent subkliniska mastiter och upp till 30 procent kliniska. Bufflar är också en mycket viktig del av Indiens mjölkproduktion. Det är svårt att hantera kronikerna eftersom det är i princip omöjligt att slakta kor i Indien. Antibiotika är mycket lättillgängliga och vem som helst kan köpa. Det nystartade juverhälsoprogrammet bygger på CMT-paddling. Gårdar med höga värden ombeds ge sina kor oralt tillskott av trinatriumcitrat (ett salt av citronsyra) som enligt Dr Kumar har gett bra resultat. De har också jobbat mycket med filmer, gårdsträffar och informationsmaterial. Celltalet mätt med CMT har minskat sedan projektet startade. De jobbar också en del med etnoveterinärmedicin där traditionella örter och metoder används. Ett mycket intressant och annorlunda föredrag (ett av mina förslag i organisationskommittén).

indien

Sedan gick vi över till något helt annat. Snorri Sigurdsson från Seges i Danmark berättade om utvecklingen av robotmjölkning (AMS) i Norden samt lite annan statistik. Han inledde med att berätta om det nordiska samarbetet, genom NMSM (nordiska mejeriorganisationen), och varför det är så viktigt. Norge har flest antal gårdar, Island minst antal och Danmark producerar mest mjölk och har störst besättningsstorlek. Flest gårdar med AMS i Norge, men högst andel AMS i Sverige där en fjärdedel av besättningarna har robot. Danmark har flest AMS-enheter. Robotarna ökar fortfarande i Norge, Island och Finland men har planat ut i Danmark och Sverige.

Vi i Norden samarbetar bland annat genom den nordiska mejeriorganisationen
Vi i Norden samarbetar bland annat genom den nordiska mejeriorganisationen

Finola McCoy från Irland berättade om CellCheck, det irländska nationella juverhälsoprogrammet. Projektet, som beror på ett ökat celltal på Irland, ska hålla på till 2020 och ska leda till att 75 procent av besättningarna ska ha ett tankcelltal under 200 000 celler/ml. Irland har 1,25 miljoner mjölkkor och 17 000 besättningar. Medelbesättningen har 64 kor. Driften är betesbaserad (240 dagar på bete). I projektet jobbar man med beteendeförändringar och har knutit beteendevetare till projektet. De jobbar med belöningar där de bästa gårdarna får pris och med information i form av ett månatligt nyhetsbrev samt fokusgrupper. Lantbrukarna kan också göra kostnadsberäkningar på nätet. Lite som det svenska celltalsprojektet med celltalsakuten. Men mycket snyggare förpackat måste medges. Hittills har projektet varit framgångsrikt med en stadig minskning av celltalet.

Nu laddar dessvärre min dator snart ur så de tre sista föredragen om mastithälsoarbete i Italien, Kanada och Frankrike får vi ta någon annan gång.

Tack för mig för denna gång!

tack