Bakteriologisk odling eller PCR-analys av mjölkprover?

Det vanligaste sättet att undersöka mjölkprover för att fastställa vilken bakterie som orsakat till exempel en celltalsförhöjning är med bakterieodling, men på senare år kan även mjölkproverna undersökas med hjälp av PCR-analys. Vid bakterieodling av mjölkprover är man beroende av att det finns levande och någorlunda pigga bakterier i provet för att de ska växa på en odlingsplatta. Bakterieodling är en relativt billig metod, men det tar 1-2 dygn innan man har ett svar. Vid PCR-analys påvisas DNA från olika bakterier och bakterierna behöver därför inte vara levande eller livskraftiga för att kunna påvisas. PCR-analys är en snabb och väldigt känslig metod, men kan bara hitta de bakterier den har utvecklats för.

Eftersom PCR-analys av mjölk är en automatiserad och snabb metod skulle man samtidigt som man analyserar celltal och mjölksammansättning i provmjölkningsproverna även kunna undersöka bakterieförekomst i dessa prover. Då skulle man både får reda på vilka kor som har höga celltal, men samtidigt också vilken bakterie som kanske orsakat celltalshöjningen. Innan man kan införa en sådan analys är det dock viktigt att undersöka hur bra metoden fungerar på just provmjölkningprover – kommer alla provsvar visa på bakteriefynd då metoden är så känslig? Kommer även kor med bakterier i endast en juverdel att kunna hittas?

För att svara på dessa frågor har vi i ett forskningsprojekt undersök hur väl resultaten från PCR-analys av provmjölkningsprover överensstämmer med konventionell bakterieodling av juverdelsmjölkprover tagna vid samma tillfälle. Endast kliniskt friska kor provtogs i denna studie.

I de allra flesta mjölkproverna (85-92 % av proverna, se figur 1) kunde vi inte påvisa de vanligaste förekommande mastitbakterierna (Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae eller Streptococcus uberis) varken med PCR-analys eller med bakterieodling (se figur 1, de gröna staplarna). Detta var förväntat eftersom korna mjölkproverna togs ifrån var kliniskt friska och de borde inte ha bakterier i mjölken. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) var dock desto vanligare att påvisa, men då framförallt med PCR-analys (se figur 1, de gula och röda staplarna).

bcpcrgraftillwebben

Figur 1. Överensstämmelse mellan bakteriefynd i mjölkprover analyserade med bakterieodling eller PCR-analys för fyra vanliga mastitorsakande bakterier. BO-=Bakterien inte påvisad med bakterieodling, BO+=Bakterien påvisad med bakterieodling, PCR-=Bakterien inte påvisad med PCR-analys, PCR+=bakterien påvisad med PCR-analys, KNS=Koagulasnegativa stafylokocker.

När resultatet inte överensstämde mellan bakterieodling och PCR-analys (se figur 1, de gula eller blåa staplarna) var det vanligare att PCR-analysen påvisade bakterier där bakterieodlingen inte påvisade någon bakterie än att bakterieodlingen påvisade bakterier där PCR-analysen inte påvisade någon bakterie. Så generellt sett hade PCR-analysen en bättre förmåga att kunna påvisa bakterier i mjölkprov jämfört med bakterieodling.

Frågan är dock om de bakterier som påvisades alltid hade betydelse för juverhälsan hos de kor som provtogs. Tittar vi på hur celltalet ser ut hos de kor där bakterier påvisat (figur 2) kan vi se att mediancelltalet ligger högre hos de kor där bakterieodlingen påvisade bakterier än hos de kor där PCR-analysen påvisade bakterier. Detta kan tyda på att en del av de bakterier som påvisades i PCR-analysen eventuellt inte kom från juvret utan var en kontamination från till exempel spenhuden eller omgivningen och som då inte heller hade en påverkan på celltalet.

bcpcrcellgraftillwebben

Figur 2. Celltal i mjölk hos kor med fynd av olika mastitorsakande bakterier påvisade med bakterieodling (BO+) eller PCR-analys (PCR+).

Slutsatsen från projektet är att PCR-analys av provmjölkprover oftast är bättre på att påvisa bakterier än bakterieodling av juverfjärdedelsprover tagna vid samma tillfälle, men att inte alla bakterier som påvisas av PCR-analysen verkar ha en direkt påverkan på celltalet. Om PCR-analys ska användas för analys av provmjölkningsprover bör man tillämpa en aseptisk provtagning för att minska risken för att få med kontaminationsbakterier.

Mer information om PCR-analys finns på SVAs hemsida:  http://www.sva.se/analyser-och-produkter/analyser-av-djur-och-foder/notkreatur1/mastit

Vad ligger celltalet på hos en frisk ko?

När vi pratar om celltal hos mjölkkor menar vi generellt antalet vita blodkroppar per milliliter mjölk. Celltalet påverkas av många olika faktorer, till exempel laktationsstadium, ras och ålder, men den enskilt viktigaste faktorn som påverkar celltalet är om kon har fått en infektion i juvret som lett till ett inflammatoriskt svar. De vita blodkropparna försvarar juvret mot de invaderande mikroorganismerna och celltalet kan öka till flera miljoner celler per milliliter mjölk.

Men vad ligger celltalet på hos en frisk ko?

Resultat från vår egen forskning visar att över hälften av korna utan fynd av bakterier i juvret har ett celltal under 50 000 celler per milliliter mjölk och att de allra flesta har ett celltal under 200 000 celler per milliliter mjölk oavsett ålder, ras och laktationsstadium (se figur).

diagramcelltal2

Vid fynd av koagulasnegativa stafylokocker, som historiskt sett inte orsakat så höga celltal hos kor, är det också en majoritet av korna som ligger under 200 000 celler per milliliter mjölk, men andelen kor med mindre än 50 000 celler per milliliter mjölk är betydligt lägre än för kor utan fynd av bakterier.

Majoriteten av kor med fynd av övriga bakterier, så som till exempel Staphylococcus aureus eller Escherichia coli, har ett celltal över 200 000 celler per milliliter mjölk och cirka hälften av korna har ett celltal på över 400 000 celler per milliliter mjölk.

Även om andra faktorer än infektion i juvret av mikroorganismer kan påverka celltalet är de faktorerna ofta svåra att göra något åt. Att celltalet stiger med kons ålder, eller att SRB-kor har lägre celltal än kor av svensk holstein-ras är svårt att direkt påverka. Däremot går det att förhindra att kor får juverinflammation orsakad av mikroorganismer genom ett förebyggande juverhälsoarbete.

Man tjänar pengar på att ha kor med låga celltal; redan vid ett celltal över 50 000 celler per milliliter mjölk minskar mängden producerad mjölk. I vår studie kunde vi se att en ko med ett celltal på cirka 50 000 celler per milliliter mjölk producerade cirka 4 kg mer mjölk per dygn jämfört med en ko med ett celltal på cirka 200 000 celler per milliliter mjölk.

Friska kor har låga celltal och kor med lågt celltal producerar mer mjölk!

Koagulasnegativa stafylokocker – spelar det någon roll vilken sort?

KNSparad

Staphylococcus epidermidis (S epidermidis), S chromogenes, S simulans… Sedan 2013 har många mer eller mindre okända bakterienamn dykt upp på svaren från SVA. Anledningen till detta är INTE att vi helt plötsligt fått in en massa nya bakterier i Sverige utan att vi på SVA fått tillgång till en ny analysmetod för att med stor säkerhet artbedöma bakterier och äntligen kan vi i stället för att bara rapportera exempelvis koagulasnegativa stafylokocker (KNS) faktiskt ange vilken KNS som finns i mjölkprovet.

Vad är koagulasnegativa stafylokocker?

Koagulasnegativa stafylokocker är en stor grupp av bakterier, totalt har ca 40 olika arter påvisats varav ca 20 i mjölk, som har gemensamt att de är stafylokocker och att de testar negativ på koagulastestet. Det har dock tidigare inte funnits metoder för att på ett säkert och kostnadseffektivt sätt artbedöma KNS så därför har man bara rapporterat dem som KNS, tills nu då.

KNS-projektet…

KNS1

Trots att KNS är det näst vanligaste fyndet vid subklinisk mastit  i Sverige vet vi inte så mycket om denna grupp av bakterier, mycket för att den har ansetts bara orsaka milda fall av mastit. Det är dock inte troligt att alla de ca 20 KNS arterna som påvisats hos mjölkkor beter sig lika. För att få bättre kunskap om vad det kan finnas för skillnader mellan våra vanligaste KNS arter startades på SVA ett forskningsprojekt i september 2014. Projektet håller nu på att avslutas.

Är det någon skillnad mellan olika KNS-arter?

Några av de preliminära resultaten visar att det är framförallt fyra KNS arter som dominerar i de inskickade mjölkproverna; S epidermidis, S chromogenes, S simulans och S haemolyticus.

Staphylococcus chromogenes  -är ett vanligt fynd framförallt hos förstakalvare och är den KNS art (av de fyra vanligaste) som ger lägst celltalshöjning, medan S epidermidis orsakar ett signifikant högre celltal än S chromogenes.

Staphylococcus epidermidis, S chromogenes, S simulans verkar ge mer persistenta mastiter och påvisas oftare vid upprepad provtagning jämfört med S haemolyticus.

Vi kan även se en skillnad i β-laktamas produktion (som visar om bakterierna är känsliga för penicillin eller inte) mellan KNS-arterna, där t.ex. 60 % av S haemolyticus isolaten producerade β-laktamas , medan inga av S simulans isolaten gjorde det.

Vi har hittills inte kunnat hitta några signifikanta skillnader mellan arterna gällande mjölkproduktion eller utslagning. De slutliga statistiska analyserna kommer att påbörjas i maj 2016. Klart är att det finns skillnader i påverkan på juverhälsa mellan olika KNS-arter och att mer specifik rådgivning gällande respektive art kan behövas.

KNS2