Streptococcus agalactiae del 2 – provtagning

Här kommer andra delen av sammanfattningen från vårt seminarium om Streptococcus agalactiae.  Nästa del kommer att handla om diagnostik.

Provtagning vid Streptococcus agalactiae-misstanke

Provtagning kan ske på besättningsnivå, konivå eller juverdelsnivå. Vilken provtagning och vilken diagnostik som passar bäst beror på varför provet tas.

Tankmjölksprov

Prov på besättningsnivå görs framförallt via tankmjölk och bara med hjälp av PCR-diagnostik som är känsligare än odling. Det är viktigt att vara medveten om att det blir en väldigt stor utspädningseffekt i tankmjölk. Man kan räkna med att hitta en smittad ko bland 50-100 kor i tanken men det beror på hur mycket bakterier kon utsöndrar vid provtagningstillfället. Ofta mjölkar kon mindre på den smittade juverdelen vilket gör att utspädningseffekten blir ännu större.

Själva provtagningen ska göras när alla djur man vill ha med finns i tanken. Omröraren ska ha varit på i minst 10 minuter. Tas provet från tappkranen bör tre gånger mängden mjölk som ryms i tappkranen hällas ut innan provet tas.

Proverna tas helst i mjölkrör som innehåller bronopol och därmed konserveras som vid provtagningstillfället.

Individprover

Det går inte att välja ut djur eller juverdelar för provtagning baserat på celltal eller CMT. Hälften av alla kor som bär på Streptococcus agalactiae har CMT 1-2 och en fjärdedel har ett celltal under 200 000 celler (CMT 1).

Vare sig diagnostiken sker med PCR eller odling är det viktigt att ta rena prover för att säkert kunna lita på resultatet. Juver och spene rengörs på samma sätt som vid provtagning för odling, se provtagningsanvisning här. Provtagning för PCR kan gärna göras genom samlingsprover på djurnivå och tas helst i mjölkrör med bronopol.

Individprover via provmjölkning

Prover kan också tas ut via provmjölkningen vilket är väldigt smidigt när det är många djur som ska provtas samtidigt. Observera att det finns en risk för så kallad ”carry-over”, det vill säga att bakterier från kon som mjölkas innan kommer med i provet från nästa ko. PCR:en detekterar både levande och döda bakterier och är mycket känslig. Bakterier som finns i miljö eller på spenhud kan detekteras om proverna inte tas aseptiskt.

Vid svagt positiva prover från provmjölkningsprover är det viktigt att ta om proverna på ett aseptiskt sätt, se provtagningsinstruktionen.

Ovanlig variant av Staphylococcus aureus

Den här ovanliga Staphylococcus aureus-stammen hittade jag på mastitavläsningen för någon vecka sedan:

Observera att det är de pyttesmå kolonierna (inringade) som är Staphylococcus aureus. De växte väldigt dåligt och såg mer ut som Trueperella pyogenes än stafylokocker.

Efter att ha typat den flera gånger med maldi-tof (med samma resultat varje gång) fick jag acceptera att det faktiskt var en mycket ovanlig variant av Staphylococcus aureus.

Så här såg stammen ut i motljus (där det faktiskt går att skymta dubbelhemolys):

Mer om mastiter orsakade av Staphylococcus aureus kan du läsa på SVAs hemsida.

 

Nytt provtagningskit för de som inte tar mjölkprover så ofta

Vilande lamm
Foto: Bengt Ekberg

För att underlätta för de som inte skickar in mastitprover så ofta, till exempel får och getbesättningar, har SVA tagit fram ett provtagningskit som gör det enklare att skicka in ett eller två till fyra prover. Provtagningskitten innehåller allt som behövs för att skicka in  mjölkprover till SVA.

 

I kittet för ett prov ingår:

1 mjölkrör
1 transporthylsa
1 remiss
1 provtagningsinstruktion
1 föradresserad jiffypåse med porto betalt

2016 års kostnad per kit är 30 kr exklusive moms

I ett kit för upp till fyra prover ingår:

4 mjölkrör
1 transporthylsa
1 remiss
1 provtagningsinstruktion
1 föradresserad jiffypåse med porto betalt

2016 års kostnad per kit är 65 kr exklusive moms

Kitten kan enkelt beställas från Staben för vaccinberedskap på SVA:
Telefon: 018-67 43 00 (helgfria vardagar kl. 9.00-16.30, maj-augusti 9.00-15.50)
Fax: 018-67 43 93
E-post: order@sva.se

 

Bakteriologisk odling eller PCR-analys av mjölkprover?

Det vanligaste sättet att undersöka mjölkprover för att fastställa vilken bakterie som orsakat till exempel en celltalsförhöjning är med bakterieodling, men på senare år kan även mjölkproverna undersökas med hjälp av PCR-analys. Vid bakterieodling av mjölkprover är man beroende av att det finns levande och någorlunda pigga bakterier i provet för att de ska växa på en odlingsplatta. Bakterieodling är en relativt billig metod, men det tar 1-2 dygn innan man har ett svar. Vid PCR-analys påvisas DNA från olika bakterier och bakterierna behöver därför inte vara levande eller livskraftiga för att kunna påvisas. PCR-analys är en snabb och väldigt känslig metod, men kan bara hitta de bakterier den har utvecklats för.

Eftersom PCR-analys av mjölk är en automatiserad och snabb metod skulle man samtidigt som man analyserar celltal och mjölksammansättning i provmjölkningsproverna även kunna undersöka bakterieförekomst i dessa prover. Då skulle man både får reda på vilka kor som har höga celltal, men samtidigt också vilken bakterie som kanske orsakat celltalshöjningen. Innan man kan införa en sådan analys är det dock viktigt att undersöka hur bra metoden fungerar på just provmjölkningprover – kommer alla provsvar visa på bakteriefynd då metoden är så känslig? Kommer även kor med bakterier i endast en juverdel att kunna hittas?

För att svara på dessa frågor har vi i ett forskningsprojekt undersök hur väl resultaten från PCR-analys av provmjölkningsprover överensstämmer med konventionell bakterieodling av juverdelsmjölkprover tagna vid samma tillfälle. Endast kliniskt friska kor provtogs i denna studie.

I de allra flesta mjölkproverna (85-92 % av proverna, se figur 1) kunde vi inte påvisa de vanligaste förekommande mastitbakterierna (Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae eller Streptococcus uberis) varken med PCR-analys eller med bakterieodling (se figur 1, de gröna staplarna). Detta var förväntat eftersom korna mjölkproverna togs ifrån var kliniskt friska och de borde inte ha bakterier i mjölken. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) var dock desto vanligare att påvisa, men då framförallt med PCR-analys (se figur 1, de gula och röda staplarna).

bcpcrgraftillwebben

Figur 1. Överensstämmelse mellan bakteriefynd i mjölkprover analyserade med bakterieodling eller PCR-analys för fyra vanliga mastitorsakande bakterier. BO-=Bakterien inte påvisad med bakterieodling, BO+=Bakterien påvisad med bakterieodling, PCR-=Bakterien inte påvisad med PCR-analys, PCR+=bakterien påvisad med PCR-analys, KNS=Koagulasnegativa stafylokocker.

När resultatet inte överensstämde mellan bakterieodling och PCR-analys (se figur 1, de gula eller blåa staplarna) var det vanligare att PCR-analysen påvisade bakterier där bakterieodlingen inte påvisade någon bakterie än att bakterieodlingen påvisade bakterier där PCR-analysen inte påvisade någon bakterie. Så generellt sett hade PCR-analysen en bättre förmåga att kunna påvisa bakterier i mjölkprov jämfört med bakterieodling.

Frågan är dock om de bakterier som påvisades alltid hade betydelse för juverhälsan hos de kor som provtogs. Tittar vi på hur celltalet ser ut hos de kor där bakterier påvisat (figur 2) kan vi se att mediancelltalet ligger högre hos de kor där bakterieodlingen påvisade bakterier än hos de kor där PCR-analysen påvisade bakterier. Detta kan tyda på att en del av de bakterier som påvisades i PCR-analysen eventuellt inte kom från juvret utan var en kontamination från till exempel spenhuden eller omgivningen och som då inte heller hade en påverkan på celltalet.

bcpcrcellgraftillwebben

Figur 2. Celltal i mjölk hos kor med fynd av olika mastitorsakande bakterier påvisade med bakterieodling (BO+) eller PCR-analys (PCR+).

Slutsatsen från projektet är att PCR-analys av provmjölkprover oftast är bättre på att påvisa bakterier än bakterieodling av juverfjärdedelsprover tagna vid samma tillfälle, men att inte alla bakterier som påvisas av PCR-analysen verkar ha en direkt påverkan på celltalet. Om PCR-analys ska användas för analys av provmjölkningsprover bör man tillämpa en aseptisk provtagning för att minska risken för att få med kontaminationsbakterier.

Mer information om PCR-analys finns på SVAs hemsida:  http://www.sva.se/analyser-och-produkter/analyser-av-djur-och-foder/notkreatur1/mastit

Mastitbakterier i siffror

Jag har sammanställt vilka som är de vanligaste (och de mer ovanliga)fynden i de mjölkprover som kommer in till SVA. Siffrorna bygger på drygt 16 000 mjölkprover som kommit in till SVA under september 2015 till och med augusti 2016. Proverna kommer både från kliniska mastiter, subkliniska mastiter och diverse andra provtagningsorsaker.

Baserat på drygt 16 000 prover inkomna till SVA.
Baserat på drygt 16 000 prover inkomna till SVA.

De två vanligaste diagnoserna är ingen växt alls (vilket i mina ögon bara är ett bevis på att provet är taget på rätt sätt) och tyvärr också blandflora. Blandflora innebär att vi inte kunnat hitta någon specifik infektion men att bakterien som orsakar problemen mycket väl kan finnas i provet men döljs av andra bakterier. Här kan ni se hur prover ska tas för att undvika blandflora och här kan ni läsa om fler tips för att ta det perfekta mjölkprovet.

Den här tabellen visar de lite mer ovanliga juverpatogenerna som vi hittat färre än 100 gånger samma tidsperiod:

diagnoser-2015-2016-ovanligare-2

 

 

Helcococcus vad är det?

På senaste tiden har vi svarat ut en för oss ny bakterie – Helcococcus species eller Helcococcus ovis. Det är en grampositiv bakterie som ofta växer ihop med Trueperella pyogenes ( fd Arcanobacterium pyogenes, fd Actinomyces pyogenes).

Vi ser framförallt bakterien vid kliniska mastiter och den kan förekomma både själv och tillsammans med pyogenes. Bakterien växer långsamt och ser bara ut som en grön hinna de första dagarna men i kombination med med pyogenes växer den bättre.

Varför har vi börjat svara ut den här bakterien?
Tidigare har vi inte kunnat typa Helcococcus men med vår nya typningsteknik maldi-tof kan vi nu artbestämma det som vi tidigare bara trott varit en missfärgning av plattan.

helcococcus2
Helcococcus ser mest ut som en grönfärgning på plattan

Vad har den för betydelse?
Tyvärr vet vi inte vad bakterien har för betydelse vid juverinflammationer förutom att den inte är helt ovanlig vid kliniska mastiter.

Helcococcus ovis bland annat hittats i samband med lungbölder hos nötkreatur och häst, endokardit hos nöt och ett fall av subklinisk mastit hos får. Det finns inga rapporter om bakterien i samband med juverinflammation hos kor.

Förhoppningsvis kommer vi lära oss mer nu när vi har möjlighet att hitta och artbestämma bakterien.

 

Tre saker att tänka på vid tolkning av PCR-resultat

ror-med-bronopol-beskuren

Vid mastitfrågeställning är PCR-resultat tacksamma – de ger svart på vitt vilken eller vilka bakterier som finns i provet, men är det verkligen så enkelt?

Här är tre viktiga saker att tänka på när du tolkar ditt PCR-svar:

1. Med PCR svaras bara de bakterier ut som finns med i den aktuella undersökningen

Vid negativt resultat är det viktigt att tänka på att mjölkprovet kan innehålla mer ovanliga bakterier som inte ingår i testen.

Vid ett positivt resultat är det också viktigt att tänka efter – även om PCR-resultatet visar på enbart en sorts bakterier kan provet mycket väl innehålla flera olika bakterier men där bara en ingår i undersökningen. Bakterien som står på svaret kanske bara är en föroreningsbakterie som egentligen förekommer i blandflora.

2. Testen är jättekänslig

PCR-undersökning vid juverhälsoproblem är mycket känsligare än odling och hittar både levande och döda bakterier.

Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae

En känslig test – det måste väl alltid vara bra? Ja – när vi letar efter bakterier som är väldigt juverbundna och inte ska finnas alls  i besättningen, till exempel Mycoplasma bovis eller Streptococcus agalactiae så är det oerhört värdefullt med en känslig test. MEN det är viktigt att tänka på att vid provmjölkningsprover finns det en risk för ”carry-over” vilket innebär att bakterier från föregående ko kommer med i provet från nästa ko. Det här kan leda till falskt positiva prover och det är viktigt att tolka svagt positiva prover med en nypa salt.

När vi letar efter omgivningsbakterier, till exempel E coli eller Streptococcus uberis som orsak till höga celltal så säger en väldigt känslig test inte så mycket. Ja bakteriens DNA finns där men är det bara en förorening eller är bakterien orsak till den subkliniska mastiten?

Speciellt när proverna inte tas efter noggrann rengöring och desinfektion, som till exempel i samband med provmjölkning, är det svårt att dra några slutsatser vid fynd av miljöbakterier.

Testen är känslig – men hittar inte en nål i en höstack!


Det är lätt att förlita sig på att PCR-undersökningen är så känslig så att den alltid hittar bakterien om den finns i besättningen. I ett tankmjölksprov som inte visar några spår av  Streptococcus agalactiae eller Mycoplasma bovis från en besättning på 300 kor kan det fortfarande dölja sig någon enstaka smittad ko. För att friförklara en besättning krävs upprepad provtagning. En tumregel är att i en besättning på 50 djur är ett PCR-resultat hyfsat pålitligt. Vid större besättningar är det viktigt att ta flera prover vid olika tillfällen.

3. Resistensundersökning

I vissa PCR-undersökningar ingår test för blaZ-genen. Om en stafylokock har blaZ-genen är den inte känslig för penicillin (det vi brukar kalla PC+). Kom ihåg att det inte går att säga om blaZ-genen, när den påvisas, hör till en koagulasnegativ stafylokock eller till en Staphylococcus aureus utan bara att genen finns i provet.

Nytt kliniskt fall av Mycoplasma bovis – upptäckt vid odling

bovismilk1
Exempel ur en gammal bok på mjölk från kor infekterade med Mycoplasma bovis

 

 

 

 

 

 

Ytterligare ett fall av den smittsamma och i Sverige relativt ovanliga mastitbakterien Mycoplasma bovis upptäcktes i en besättning i Skåne förra veckan. Det här är den tredje besättningen de senaste åren som har haft kliniska mastiter orsakade av M bovis.

Misstanken uppstod ovanligt nog genom odling (sic!)- ett prov från en kliniskt sjuk ko kom in för rutinmässig mastitodling. Tack vare vårt nya typningsinstrument, maldi-tof, började vi misstänka växt av mykoplasma. Vi kunde konfirmera att det verkligen rörde sig Mycoplasma bovis med hjälp av PCR.

Här finns mer att läsa om mastit orsakad av mykoplasma:

 

 

 

Dag 3, sista dagen mastitkonferens i Nantes

Jag vill börja med att beklaga kvaliteten på bilderna. Min mobilkamera är tyvärr inte bättre än så. Kanske går det att läsa någonting.

Alfonso Zecconi från Italien var huvudtalare på session om förebyggande/övervakning/verktyg. Han pratade om hur juverhälsan kan förbättras genom rätt beslut. Han tryckte på att övervakning och dataregistrering är fundamentalt för juverhälsoarbete. Övervakning består av diagnostik (tidig), jämförelse (benchmarking) och åtgärder. Än en gång en föreläsning som styrker att det vi gör i Sverige och Norden är rätt!

Sammanfattande slutsatser från Zecconis föredrag om hur mastit bäst kan förebyggas.
Sammanfattande slutsatser från Zecconis föredrag om hur mastit bäst kan förebyggas.

Sedan flyttade jag över till behandlingssession där min trevliga kollega Schmuel Friedman från Israel presenterade en studie om spenförslutare (nämnd tidigare i samband med Håkan Landins studie). Alla kor i Israel behandlas för närvarande med antibiotika vid sinläggning, men det finns ett ökat intresse för att minska antibiotikaanvändningen. För friska kor var det ingen signifikant skillnad mellan att inte behandla alls, att använda bara spenförslutare eller spenförslutare tillsammans med antibiotika. I den ”sjuka” gruppen var det bättre att använda en kombination av antibiotika och spenförslutare jämfört med bara antibiotika.

Micaela Sipola från Italien skulle ha pratat om ketoprofen, men Alfonso flyttade över från grannsessionen och presenterade hennes arbete. De kor med kronisk mastit som behandlades med ketoprofen ökade sin mjölkproduktion utan att själva mjölkningen tog längre tid.

Efter kafferasten med postervisning var det dags för en session om epidemiologi och bakteriologi.

En av flera postrar från SVA
En av flera postrar från SVA

Huvudtalaren David Kelton, veterinär och epidemiolog från Kanada berättande övergripande om mastitpatogener. Han pratade om värden (kon), bakterien och miljön och samspelet däremellan. Trots alla nya tillgängliga tekniker menar han att det är viktigt att åtgärdsplanen på den individuella gården hålls så pass enkel så att den verkligen följs. Han lyfte också om en amerikansk studie där lantbrukaren skickade in mjölkprover till ett labb som odlade och körde maldi-tof för artbestämning. Inom 24 timmar återkopplades svaret till både lantbrukare och veterinär. Detta liknar ju rätt mycket vårt svenska system även om vi odlar de flesta kliniska mastiter i fält.

Sammanfattande slutsatser från Dave Keltons föredrag.
Sammanfattande slutsatser från Dave Keltons föredrag.

Ann Nyman från SVA presenterade resultat från sin KNS-studie som hon har skrivit om tidigare här på bloggen. Tidigare har vi betraktat KNS som en bakterie. Men det säger sig själv att det är osannolikt att minst 20 olika arter skulle bete sig exakt likadant. Fyra arter av KNS dominerar: S. epidermidis, simulans, chromogenes och haemolyticus. Det var ganska få S. xylosus, men alla var resistenta mot penicillin. I gengäld var alla S. simulans (och S. hyicus) känsliga för penicillin. S. haemolyticys är vanligare hos holstein är SRB. Det var ingen skillnad i behandlingsincidens för klinisk mastit eller utslagning mellan de olika bakterierna. De högsta celltalen och den lägsta mjölkavkastningen sågs hos S. hyicus. S. chromogenes var vanligast hos förstakalvare. S. hyicus och S. simulans var mer persisterande än de andra. Ann gjorde en mycket bra presentation och det blev nog rekord i frågor efteråt.

Vår egen Ann Nyman presenterade resultat från sin KNS-studie.
Vår egen Ann Nyman presenterade resultat från sin KNS-studie.

Sista talaren före lunch var Ingrid Holmøy från Norge som pratade om hur Streptococcus agalactiae påverkar mjölkavkastningen. Liksom i Sverige har denna bakterie ökat efter att ha varit i det närmaste utrotad. Strep agalactiae är vanligare i större besättningar med robot och lösdrift. Infektion med Strep agalactiae gav minskad mjölkavkastning. En fråga för framtiden är om det finns olika bakteriestammar som beter sig på olika sätt.

Efter lunch kommer sista inlägget.

BS3-plattor med ovanlig växt

Anonymiserad bild där det enbart på fältet för gramnegativer
Anonymiserad bild

Förra veckan fick vi in två BS3-plattor från två helt olika distriktsveterinärstationer där det växte ovanliga (i mastitsammanhang) gramnegativa  bakterier. Det gramnegativa fälten såg även prickiga ut i agarn. På den ena plattan (se bild) var alla andra fält tomma och på den andra växte det enbart streptokocker på blodagarfältet.

Nu har vi typat bakterierna och det växte samma bakterie på båda plattorna – Ralstonia pickettii – en mycket ovanlig bakterie i mastitsammanhang men vanligt förekommande i jord och sjövatten.

Håll lite extra utkik ni som använder BS3-plattor – om det växer på gramnegativ-fältet men ingen annan stans, eller om växten på blodagarfältet inte stämmer med växten på gramnegativfältet – tolka växten med försiktighet.

Kommentera gärna om ni har liknande erfarenheter!