Bakteriologisk odling eller PCR-analys av mjölkprover?

Det vanligaste sättet att undersöka mjölkprover för att fastställa vilken bakterie som orsakat till exempel en celltalsförhöjning är med bakterieodling, men på senare år kan även mjölkproverna undersökas med hjälp av PCR-analys. Vid bakterieodling av mjölkprover är man beroende av att det finns levande och någorlunda pigga bakterier i provet för att de ska växa på en odlingsplatta. Bakterieodling är en relativt billig metod, men det tar 1-2 dygn innan man har ett svar. Vid PCR-analys påvisas DNA från olika bakterier och bakterierna behöver därför inte vara levande eller livskraftiga för att kunna påvisas. PCR-analys är en snabb och väldigt känslig metod, men kan bara hitta de bakterier den har utvecklats för.

Eftersom PCR-analys av mjölk är en automatiserad och snabb metod skulle man samtidigt som man analyserar celltal och mjölksammansättning i provmjölkningsproverna även kunna undersöka bakterieförekomst i dessa prover. Då skulle man både får reda på vilka kor som har höga celltal, men samtidigt också vilken bakterie som kanske orsakat celltalshöjningen. Innan man kan införa en sådan analys är det dock viktigt att undersöka hur bra metoden fungerar på just provmjölkningprover – kommer alla provsvar visa på bakteriefynd då metoden är så känslig? Kommer även kor med bakterier i endast en juverdel att kunna hittas?

För att svara på dessa frågor har vi i ett forskningsprojekt undersök hur väl resultaten från PCR-analys av provmjölkningsprover överensstämmer med konventionell bakterieodling av juverdelsmjölkprover tagna vid samma tillfälle. Endast kliniskt friska kor provtogs i denna studie.

I de allra flesta mjölkproverna (85-92 % av proverna, se figur 1) kunde vi inte påvisa de vanligaste förekommande mastitbakterierna (Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae eller Streptococcus uberis) varken med PCR-analys eller med bakterieodling (se figur 1, de gröna staplarna). Detta var förväntat eftersom korna mjölkproverna togs ifrån var kliniskt friska och de borde inte ha bakterier i mjölken. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) var dock desto vanligare att påvisa, men då framförallt med PCR-analys (se figur 1, de gula och röda staplarna).

bcpcrgraftillwebben

Figur 1. Överensstämmelse mellan bakteriefynd i mjölkprover analyserade med bakterieodling eller PCR-analys för fyra vanliga mastitorsakande bakterier. BO-=Bakterien inte påvisad med bakterieodling, BO+=Bakterien påvisad med bakterieodling, PCR-=Bakterien inte påvisad med PCR-analys, PCR+=bakterien påvisad med PCR-analys, KNS=Koagulasnegativa stafylokocker.

När resultatet inte överensstämde mellan bakterieodling och PCR-analys (se figur 1, de gula eller blåa staplarna) var det vanligare att PCR-analysen påvisade bakterier där bakterieodlingen inte påvisade någon bakterie än att bakterieodlingen påvisade bakterier där PCR-analysen inte påvisade någon bakterie. Så generellt sett hade PCR-analysen en bättre förmåga att kunna påvisa bakterier i mjölkprov jämfört med bakterieodling.

Frågan är dock om de bakterier som påvisades alltid hade betydelse för juverhälsan hos de kor som provtogs. Tittar vi på hur celltalet ser ut hos de kor där bakterier påvisat (figur 2) kan vi se att mediancelltalet ligger högre hos de kor där bakterieodlingen påvisade bakterier än hos de kor där PCR-analysen påvisade bakterier. Detta kan tyda på att en del av de bakterier som påvisades i PCR-analysen eventuellt inte kom från juvret utan var en kontamination från till exempel spenhuden eller omgivningen och som då inte heller hade en påverkan på celltalet.

bcpcrcellgraftillwebben

Figur 2. Celltal i mjölk hos kor med fynd av olika mastitorsakande bakterier påvisade med bakterieodling (BO+) eller PCR-analys (PCR+).

Slutsatsen från projektet är att PCR-analys av provmjölkprover oftast är bättre på att påvisa bakterier än bakterieodling av juverfjärdedelsprover tagna vid samma tillfälle, men att inte alla bakterier som påvisas av PCR-analysen verkar ha en direkt påverkan på celltalet. Om PCR-analys ska användas för analys av provmjölkningsprover bör man tillämpa en aseptisk provtagning för att minska risken för att få med kontaminationsbakterier.

Mer information om PCR-analys finns på SVAs hemsida:  http://www.sva.se/analyser-och-produkter/analyser-av-djur-och-foder/notkreatur1/mastit

Dag 3, sista dagen mastitkonferens i Nantes

Jag vill börja med att beklaga kvaliteten på bilderna. Min mobilkamera är tyvärr inte bättre än så. Kanske går det att läsa någonting.

Alfonso Zecconi från Italien var huvudtalare på session om förebyggande/övervakning/verktyg. Han pratade om hur juverhälsan kan förbättras genom rätt beslut. Han tryckte på att övervakning och dataregistrering är fundamentalt för juverhälsoarbete. Övervakning består av diagnostik (tidig), jämförelse (benchmarking) och åtgärder. Än en gång en föreläsning som styrker att det vi gör i Sverige och Norden är rätt!

Sammanfattande slutsatser från Zecconis föredrag om hur mastit bäst kan förebyggas.
Sammanfattande slutsatser från Zecconis föredrag om hur mastit bäst kan förebyggas.

Sedan flyttade jag över till behandlingssession där min trevliga kollega Schmuel Friedman från Israel presenterade en studie om spenförslutare (nämnd tidigare i samband med Håkan Landins studie). Alla kor i Israel behandlas för närvarande med antibiotika vid sinläggning, men det finns ett ökat intresse för att minska antibiotikaanvändningen. För friska kor var det ingen signifikant skillnad mellan att inte behandla alls, att använda bara spenförslutare eller spenförslutare tillsammans med antibiotika. I den ”sjuka” gruppen var det bättre att använda en kombination av antibiotika och spenförslutare jämfört med bara antibiotika.

Micaela Sipola från Italien skulle ha pratat om ketoprofen, men Alfonso flyttade över från grannsessionen och presenterade hennes arbete. De kor med kronisk mastit som behandlades med ketoprofen ökade sin mjölkproduktion utan att själva mjölkningen tog längre tid.

Efter kafferasten med postervisning var det dags för en session om epidemiologi och bakteriologi.

En av flera postrar från SVA
En av flera postrar från SVA

Huvudtalaren David Kelton, veterinär och epidemiolog från Kanada berättande övergripande om mastitpatogener. Han pratade om värden (kon), bakterien och miljön och samspelet däremellan. Trots alla nya tillgängliga tekniker menar han att det är viktigt att åtgärdsplanen på den individuella gården hålls så pass enkel så att den verkligen följs. Han lyfte också om en amerikansk studie där lantbrukaren skickade in mjölkprover till ett labb som odlade och körde maldi-tof för artbestämning. Inom 24 timmar återkopplades svaret till både lantbrukare och veterinär. Detta liknar ju rätt mycket vårt svenska system även om vi odlar de flesta kliniska mastiter i fält.

Sammanfattande slutsatser från Dave Keltons föredrag.
Sammanfattande slutsatser från Dave Keltons föredrag.

Ann Nyman från SVA presenterade resultat från sin KNS-studie som hon har skrivit om tidigare här på bloggen. Tidigare har vi betraktat KNS som en bakterie. Men det säger sig själv att det är osannolikt att minst 20 olika arter skulle bete sig exakt likadant. Fyra arter av KNS dominerar: S. epidermidis, simulans, chromogenes och haemolyticus. Det var ganska få S. xylosus, men alla var resistenta mot penicillin. I gengäld var alla S. simulans (och S. hyicus) känsliga för penicillin. S. haemolyticys är vanligare hos holstein är SRB. Det var ingen skillnad i behandlingsincidens för klinisk mastit eller utslagning mellan de olika bakterierna. De högsta celltalen och den lägsta mjölkavkastningen sågs hos S. hyicus. S. chromogenes var vanligast hos förstakalvare. S. hyicus och S. simulans var mer persisterande än de andra. Ann gjorde en mycket bra presentation och det blev nog rekord i frågor efteråt.

Vår egen Ann Nyman presenterade resultat från sin KNS-studie.
Vår egen Ann Nyman presenterade resultat från sin KNS-studie.

Sista talaren före lunch var Ingrid Holmøy från Norge som pratade om hur Streptococcus agalactiae påverkar mjölkavkastningen. Liksom i Sverige har denna bakterie ökat efter att ha varit i det närmaste utrotad. Strep agalactiae är vanligare i större besättningar med robot och lösdrift. Infektion med Strep agalactiae gav minskad mjölkavkastning. En fråga för framtiden är om det finns olika bakteriestammar som beter sig på olika sätt.

Efter lunch kommer sista inlägget.

Maj månads bakterie – vilken bakterie är det den här gången?

Med anledning av årets ringtester för kliniska mastiter så kommer här månadens bakterie. Det visade sig att den här bakterien var förvånansvärt svår att identifiera i fält.

De som deltog i ringtesten får inte svara eftersom de redan har fått facit…

Månadens bakterie majSELMA – Bakterien växer enbart på blodagarfältet och har ingen hemolys.

Mycoplasma bovis – bakterien som finns men få har sett

Foto: VetBact.org
Foto: VetBact.org – Mycoplasma bovis-kolonier ser i mikroskop ut som stekta ägg

För någon månad sedan hittades Mycoplasma bovis hos flera kor med juverhälsoproblem i en besättning i södra Sverige. Tidigare har bakterien hittats vid juverinflammation för några år sedan (2011) och i en anonym tankmjölksstudie som utfördes av Svensk Mjölk (nuvarande Växa) 2013 så påvisades bakterien i fyra besättningar av drygt 13 000 som testades.

Det är viktigt att inte glömma bort mykoplasma som orsak till juverinflammation speciellt om mastiterna drabbar flera juverdelar, leder till markant minskad produktion och inte svarar på behandling.

Det som var anmärkningsvärt i det senaste fallet var att trots att flera kor hade mykoplasma-mastiter så var tankmjölksprovet negativt. Det kan bero på att kor som hade juverinflammation inte gick i tanken eller att mykoplasmainfektionen orsakar en kraftig nedgång i mjölkproduktionen så att mjölken från de infekterade korna blev väldigt utspädd med mjölk från friska kor.

Vad är Mycoplasma bovis?

Mykoplasma är en sorts bakterie som skiljer sig från de flesta andra eftersom den saknar cellvägg. Att den inte har cellvägg gör att den är mycket svårare att behandla än många andra bakterier.

De flesta mykoplasmerna är specifika för ett djurslag och Mycoplasma bovis är nötkreaturens mykoplasma som kan ge luftvägsproblem hos kalvar, ledproblem och stora problem med juverinflammationer.

Symtom på Mycoplasma bovis-mastit

Många kor i besättningen kan drabbas. Bakterien orsakar kliniska mastiter med juverödem, nedsatt mjölkproduktion och vattnig till tjock och flockig mjölk. Om mjölkprovet får stå så blir mjölken snabbt uppdelad i en klar och en flockig del.

Typiskt utseende för mjölk från kor med M bovis-mastit

Ofta drabbas flera juverdelar. Mykoplasma kan också ge subkliniska mastiter med höga celltal som enda tecken.

Diagnostik

Mycoplasma växer inte ut vid vanliga bakterieodlingar utan kräver speciella förhållanden och tar dessutom lång tid att odla fram. Därför är PCR-diagnostik det som fungerar allra bäst för att diagnosticera mykoplasma-mastiter.

Läs mer om Mycoplasma bovis

På SVA:s hemsida kan du läsa mer om mycoplasma bovis hos kalv och mastit orsakad av mycoplasma bovis hos nötkreatur.

Här kan du även läsa Växa Sveriges riktlinjer vid ett första fall av Mycoplasma bovis-mastit.

Hemma hos – reportage på mastitlab i tidningen Land

Land hela uppslaget

Ni missar väl inte dagens Land lantbruk med Tema Mjölk – där finns ett reportage om SVA:s mastitdiagnostik.

Här finns artikeln även i digitalt format: Ovanliga mastitbakterier ökar igen.